Nathalie Joubert, institutrice de vocation, a décidé à l'aube de ses quarante ans de quitter Paris pour venir enseigner aux classes de CM1 et CM2 dans l'école du village natal de son père, La Couarde, situé sur l'île de Ré. Elle est une femme sévère mais juste qui ne manque pas d'humour, ce qui lui permet d'être respecté par ses jeunes élèves. Parallèlement à son activité professionnelle, elle élève seule Romain, son neveu de 13 ans, orphelin depuis le décès tragique de ses parents, la soeur de Nathalie et son mari.

Suite au succès du premier épisode (9 millions de téléspectateurs le 24 octobre 2005), Mademoiselle Joubert est devenu un personnage récurrent sur TF1. La série signe les premiers pas dans une fiction télévisée de Laurence Boccolini (l'animatrice de l'émission Le Maillon Faible), qui a également co-écrit les épisodes.